Rt-qPCR反应条件的控制

       实时荧光定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR)，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
　　PCR反应条件的控制：
　　1. PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子 。
　　2. 镁离子浓度 总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5 mmol/L。
　　3. 底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制，20～200 umol/L。
　　4. TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul）。
　　5. 引物 浓度一般为0.1 ～0.5 umol/L。
　　6. 反应温度
　　（1）变性温度和时间95℃，30 s。
　　（2）退火温度和时间 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。
　　（3）延伸温度和时间72℃，1 min/kb(10 kb内）。
　　（4）Tm值=4(G+C) +2(A+T)
　　7. 循环次数 ：一般为25 ～30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的 扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期"。