布鲁氏菌实时荧光RT-PCR试剂盒

       【包装规格】 25T/盒 & 50T/盒
　　【预期用途】
　　本试剂盒利用实时荧光PCR原理，定性检测，对引起的疾病诊断及疗效评估有重要指导意义。
　　【检验原理】
　　本试剂盒针对的高度保守区域设计特异性引物和探针，在反应体系中含基因组模板的情况下，PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用荧光定量PCR仪对PCR过程中相应通道信号进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。
　　布鲁氏菌实时荧光RT-PCR试剂盒【主要组成成份】
　　序号
　　组成
　　25T/盒
　　50T/盒
　　1
　　 RT-PCR反应液
　　375 μL×1管
　　750 μL×1管
　　2
　　逆转录酶
　　 50 μL×1管
　　100 μL×1管
　　3
　　 Taq酶
　　 75 μL×1管
　　150 μL×1管
　　4
　　阳性对照
　　 40 μL×1管
　　 40 μL×1管
　　5
　　阴性对照
　　 40 μL×1管
　　 40 μL×1管
　　6
　　说明书
　　1份
　　1份
　　注：阴性对照为偶蹄兽类基因组DNA，阳性对照为失去活性的cDNA。
　　【储存条件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反复冻融，有效期12个月。
　　【适用仪器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道实时荧光定量PCR仪。
　　布鲁氏菌实时荧光RT-PCR试剂盒【样本要求】
　　1. 适用标本类型：发病动物血液、空肠及小肠肠内容物及组织脏器(肠道组织、肠系膜及淋巴结等)和病毒培养液。
　　2. 标本采集，方法如下：
　　(1) 血清：用一次性注射器取静脉血2-3ml，转至5ml 的干燥管中，密闭送检。
　　(2) 肠内容物：无菌条件下取肠道内容物约1g 左右，置入1ml 含有1.0ml PBS(或生理盐水)的5ml 离心管中，立即送检。
　　(3) 组织脏器：取发病动物肠道组织及肠系膜淋巴结等组织约1g，置一1.5ml的洁净离心管中，密闭送检。
　　3.应避免标本间交叉污染。
　　4.标本收集后可立即检测；若不能立即检测，可置于2～8℃冷藏保存；如需长期保存，标本应冻存于-80℃以下，避免反复冻融。
　　【检验方法】
　　1. 试剂准备（试剂准备区）
　　（1）从冰箱中取出试剂盒, 从试剂盒中取出实验所需试剂，充分融化混匀并瞬时离心以去除管壁附着液体。
　　（2）核算当次实验所需要的反应数（n），并根据如下表所示反应体系计算当次实验所需要的各种试剂量。
　　布鲁氏菌实时荧光RT-PCR试剂盒n =阴性对照数（1T）+阳性对照数（1T）+误差预留量（1T）+样本数
　　单反液配制表(每份)
　　RT-PCR反应液
　　15.0 μL
　　逆转录酶
　　 2.0 μL
　　Taq酶
　　 3.0 μL
　　 (3)在无菌离心管中加入上述试剂，充分混匀后瞬时离心。按照20 μL/管分装量将试剂分装至PCR反应管。
　　2.样本准备（样本处理区）
　　用QIAGEN、Roche公司RNA提取试剂盒提取RNA，具体操作按照其试剂盒说明书操作。
　　3.加样
　　在上述制备好的PCR反应样本管中分别加入处理好的待测标本RNA各5 μl、终体积25 μl/管，盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到PCR仪器上。阴性对照和阳性对照管则各加5 μL试剂盒自带的阴性对照或阳性对照品，终体积为25 μl/管，盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到PCR仪器上。
　　4. PCR（PCR扩增区）
　　（1）取样本处理区准备好的PCR反应管，放置在实时荧光定量PCR仪样品槽相应位置，并记录放置顺序。
　　（2）按下表设置仪器核酸扩增相关参数进行PCR扩增。布鲁氏菌实时荧光RT-PCR试剂盒
　　反应体积
　　25 μL
　　通道选择
　　FAM通道采集荧光信号
　　PCR
　　反应
　　条件
　　步骤
　　条件
　　循环数
　　反转录
　　  42℃：10分钟（min）
　　1
　　预变性
　　95℃：3分钟（min）
　　1
　　预扩增
　　95℃：5秒（s）
　　5
　　55℃：40秒（s）
　　PCR扩增
　　95℃：5秒（s）
　　40
　　55℃：40秒（s）
　　（此阶段结束时采集荧光信号）
　　注：ABI系列荧光PCR仪在设置时不选ROX校正，设置淬灭基团选择None。
　　【参考值（参考范围）】
　　1.试剂盒有效性判定：
　　 （1）阳性对照：有典型S型扩增曲线或Ct值≤35。
　　 （2）阴性对照：Ct值＞38或无Ct值，线形为直线或轻微斜线，无指数增长期。
　　2.标本结果判定：
　　（1）阳性：标本检测结果Ct值≤35或有明显指数增长期。
　　（2）可疑：标本检测结果Ct值在35～38范围内。此时应对标本进行重复检测，如重复实验结果Ct值仍在35～38范围内，有明显指数增长期，则判定为阳性，否则为阴性。
　　（3）阴性：标本检测结果Ct值＞38或无Ct值。
　　【检验结果的解释】
　　通道及检测结果
　　标本检测结果解释
　　FAM
　　阳性（＋）
　　标本中检出RNA
　　阴性（－）
　　标本中未检出RNA
　　【检验方法的局限性】
　　【产品性能指标】 产品的检出限为102 Copies/mL，产品CV值≤5%。
　　【注意事项】
　　布鲁氏菌实时荧光RT-PCR试剂盒
　　原创作者：上海雅吉生物科技有限公司