薄层层析法黄曲霉**B1的测定

       薄层层析法黄曲霉**B1的测定 一、原理 样品中AFTB1经有机溶剂提取、净化、浓缩并经薄层色谱分离后，在波长365nm紫外光下产生荧光，根据其在薄层板上显示荧光的强度与标准品AFTB1*低检出量产生的荧光强度比较来测定样品中AFT B1的含量。 二、试剂（AR） 正己烷（AR沸程30-60）或石油醚（沸程60-90）甲醇（AR）苯 （AR）乙腈 （AR）无水（AR）丙酮 （AR）（以上试剂应重蒸，并应经检验对薄层色谱测定无干扰）苯-乙腈(98:2)混合溶液甲醇-水（55:45）混合溶液三（AR）氯化钠（AR）（AR）硅胶G（薄层色谱用）5%次氯酸钠溶液：称取100g漂白精，加入500mL水，搅匀。另将80g工业用（Na2CO3.10H2O）溶于500mL温水中，倒入上述溶液中，搅匀，澄清过滤后贮存于带橡皮塞的玻璃瓶中，用作**剂。黄曲霉**B1标准贮备液：用百万分之一的微量分析天平精密称取1-1.2mgAFTB1标准品，先加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀释至100mL，避光置于4℃冰箱中保存。使用前用紫外分光光度计测定其浓度，再用苯-乙腈混合溶液调整其浓度为10ug/mL。（在350nm测定AFTB1的苯-乙腈溶液的吸光度，其摩尔消光系数为19800，可根据朗伯-比尔定律求出其浓度）。黄曲霉**B1标准应用液I（1ug/mL）：吸取1.0mL10ug/mL的黄曲霉**B1标准贮备液于10mL容量瓶中，加苯-乙腈混合溶液定容。黄曲霉**B1标准应用液II（0.2ug/mL）：吸取1.0mL1ug/mL的黄曲霉**B1标准应用液I于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合溶液定容。黄曲霉**B1标准应用液III(0.04ug/mL)：吸取1.0mL0.2ug/mL的黄曲霉**B1标准应用液II于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液定容。 三、主要仪器玻璃板：5×20cm涂布器色谱展开槽（25×6×4cm）紫外光灯：100-125W，带有波长365nm滤光片微量注射器：20uL,10uL各一支四、操作步骤1、样品预处理 称取4g混匀的花生油样品于小烧杯中，用20mL石油醚或正己烷，将其转移到125mL分液漏斗中，用20mL甲醇-水溶液分数次洗烧杯，洗液并入分液漏斗中，振摇2分钟，静止分层后，将下层甲醇-水溶液移入**分液漏斗，再用5mL甲醇-水溶液重复提取一次，提取液并入**分液漏斗中。在**分液漏斗中加入20mL，振摇2分钟，静止分层后，放出层，经盛有约10g先用湿润的的慢速滤纸过滤于50mL蒸发皿中，分液漏斗中再加5mL提取一次，层一并滤入蒸发皿中，*后用少量洗过滤器，洗液并入蒸发皿中。在通风柜中，将蒸发皿于65℃水浴上挥干，然后放入冰盒上泠却2-3分钟，准确加入1mL苯-乙腈混合液，用带橡皮头滴管的管尖将残渣充分混合，若有结晶析出，将蒸发皿取下，继续溶解、混匀，晶体消失后用滴管吸取上清液转移于2mL具塞试管中。2、样品测定1>薄层板的制备 称取约3g硅胶G，加相当于硅胶量的2-3倍左右的水，用力研磨1-2分钟，至成糊状后立即倒入涂布器内，推铺成5×20cm、厚度为0.25mm的薄层板三块。于空气中干燥约15分钟后，在100℃下活化2小时，取出放入干燥器中保存。2>点样 将薄层板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板底端3cm的基线上用微量注射器滴加样液和标准液：**点：10uL 0.04ug/mLAFT B1 标液**点：20uL样液第三点：20uL 样液 + 10uL0.04ug/mL AFT B1 标液第四点：20uL 样液 + 10uL0.2ug/mL AFT B1 标液要求点距边缘和点间距约为1cm,样点直径约3cm,大小相同，点样时可用电吹风冷风边吹边点。3>展开 在展开槽内加10mL无水，将点好样的薄层板预展12cm，取出挥干。再于另一展开槽内加10mL丙酮+（8+92）混合溶剂，展开10-12cm，取出挥干。4>结果观察将展开好的薄板放在365nm的紫外灯光下观察：a.若**点无荧光或都无荧光。说明薄板或展开剂未制备好，需重新制备。b.**点有荧光，而其余三点无荧光。说明样液中有荧光猝灭剂，样液需重新制备。c.**点有荧光，**点无荧光，三、四点有荧光。说明样液不含AFT B1或含量小于*低检出量。d.四个点都有荧光。需做确证实验后再进行定量。5>确证实验于另一薄板上左边依次点二个样：**点：10uL0.04ug/mL AFTB1标液**点：20uL样液在以上两点各加一小滴三（TFA），待反应5分钟后，用电吹风热风2分钟，使温度不高于40℃。再于薄层板的右边点以下二个点：第三点：10uL 0.04ug/L AFTB1 标液第四点：20uL样液同第3>步展开后，于紫外光下观察样液是否产生与AFTB1标准点相同的衍生物AFT B2a,未加TFA的第三、四点作空白对照。6>稀释定量若**点的荧光强度比**点强，则根据其强度估计减少点样体积，于另一薄板上点四个点：**点：10uL 0.04ug/mLAFT B1标液**点：10uL样液第三点：15uL样液第四点：20uL样液展开后取荧光强度与**点相同的样点进行计算。五、计算 X = X ——样品中AFT B1的含量ug/kg(ppb)V1——稀释前样液的总体积mLV2——出现同等荧光强度的稀释后样液点样量uLD ——样液的稀释倍数