钰博生物文献：外泌体内的miR-221通过靶向调控DNM3促进神经胶质瘤恶性进展和抵抗

       外泌体内的miR-221通过靶向调控DNM3促进神经胶质瘤恶性进展和抵抗
　　摘要：脑胶质瘤在中枢神经系统中高发,且预后很差。即使给予术后放疗、或联合治疗,脑胶质瘤患者的复发率仍然很高,治疗效果始终不能令人满意。随着基因水平研究的不断深入,有关胶质瘤的基因分子机制得到深入的探索。O6-甲基-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA methyhransferase,MGMT)启动子甲基化、1p/19q杂合性缺失、异柠檬酸脱氢酶1(Isocitrate dehydrogenase 1,IDH1)基因突变、ATRX表达缺失等均已经成为胶质瘤病理学诊断的重要分子生物学标记,也丰富了人们对于肿瘤基因变异的认识。Stephen Paget于1889年提出肿瘤生长的“种子-土壤”学说,奠定了肿瘤微环境的概念。外泌体是肿瘤微环境中的重要成分。它通过释放自身携带的细胞因子参与了肿瘤的发生、增殖、侵袭和抵抗等生物学过程。而肿瘤细胞来源的外泌体(Tumor cells derived exosome,Texo)由于它的结构特征和运输功能已经成为近年来肿瘤领域的研究热点。2013年,美国、德国3位科学家凭借他们所发现的细胞囊泡运输的调节机制,荣获2013年诺贝尔生理学或医学奖。外泌体(exosome)作为人体内一类重要运输囊泡,也开始受到越来越多的关注。科学家们已发现,外泌体会参与到肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭、凋亡、血管生成、炎症反应、免疫应答等重要的生物过程,细胞会通过分泌外泌体,将一些信号分子分泌到较远的组织或细胞中,以起到调控作用。外泌体作为药物传递系统(Drug delivery system,DDS)为高效药物投递提供天然的内源性纳米级载体,其靶向作用的潜力也逐渐被发现。miRNA是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,可以与靶mRNA的3’非翻译区(Untranslated Regions,UTR)结合从而在转录后水平调节靶基因的表达。有研究显示,miR-221在直肠癌、胰腺癌、乳腺癌和膀胱癌中是一种促癌基因。利用高通量筛选测序平台筛选脑胶质瘤组织miRNA差异表达情况,筛选出了胶质瘤组织内miR-221高表达,特别是胶质母细胞瘤组织。考虑到胶质瘤细胞外泌体内miR-221的表达情况以及调节机制尚未进行过研究,故在本实验中我们选取胶质瘤细胞来源的外泌体miR-221作为研究对象,进行体内外细胞和外泌体miR-221表达的检测,并通过CCK-8实验,流式细胞技术以及Transwell实验探讨其对于胶质瘤的作用。然后进一步寻找miRNA的靶基因。DNM3(Dynamin 3)是发动蛋白超家族(包括DNM1、DNM2、DNM3)中的一员,参与许多膜转运功能,例如胞质分裂、吞噬作用、转运囊泡出芽和细胞流动等。最近的研究表明,DNM3的高表达可抑制细胞增殖及诱导凋亡。基于对目前已有文献的充分分析,我们推测miRNA-DNM3途径有可能成为抑制神经胶质瘤生长及放增敏的治疗靶点。由于DNM3出现在Targetscan的预测结果中,我们进一步研究其与miR-221的关系。实验中我们确定了miR-221的靶基因DNM3以及miR-221的转录调控因子RELA,并通过双荧光素酶报告基因实验得以证实,并分析它们表达量的相关性,最后通过病毒转染实验证实miR-221对胶质瘤的作用是通过靶向调控DNM3引起的,并受上游RELA的转录调控。部分miR-221在人脑胶质瘤组织和GBM源性外泌体内的表达及其与胶质瘤WHO病理分级的关系目的:研究miR-221在人脑胶质瘤组织和GBM源性外泌体内的表达,并分析miR-221的表达与胶质瘤WHO病理分级的关系。方法:1 48例胶质瘤患者及11例非肿瘤患者组织标本均于2015年采集自河北医科大学第二医院神经外科。包括23名女性,36名男性,年龄从30至68岁。标本采集后迅速放至液氮中冷冻,然后-80℃低温保存。诊断结果均由2位病理医师根据WHO分级指导得出。2抽取上述患者的静脉血,室温静置后获得血清或者采集后立即离心获得血浆上清液,提取外泌体。3 SHG-44、U87MG、HEB和U251的培养,及细胞外泌体的提取。4定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)方法测定神经胶质瘤组织或外泌体内miR-221含量。5应用t检验分析神经胶质瘤中miR-221含量与胶质瘤级别或不同细胞系之间的关系。结果:1 miRNA-221在人脑胶质瘤组织中表达上调:与对照组织比较,胶质瘤组织中miRNA-221均呈高表达(P