尼康显微镜的创新

       在所有科学仪器中，可能没有人比光学显微镜对它的改进有更多的思考和投入。它在过去几个世纪中的发展一直受到科学家的推动，他们希望观察和测量比以往任何时候都更小，更微弱（图1）和更深的组织内部现象。

　　图1显示了当今改进型显微镜产生的图像的示例，该图像说明了在Eclipse E600显微镜上使用CFI60 40X萤石物镜和尼康的DXM1200数码相机拍摄的组织培养细胞的数字捕获多色荧光图像。
　　一个世纪前，显微镜达到了光的经典理论所预测的分辨率极限。但是，需要更多的分辨率才能使显微镜实时检查活细胞的内部运作。以前由极少数技术大师在极少数实验室中完成的技术现在简化为简单的常规临床程序。显微镜设计人员认真听取了显微镜专家的意见，带来了巨大的创新。本文总结了显微镜设计的进展，并着重于最近开发的光学系统如何促进科学进步。
　　在生物显微镜相对简单的日子里，在落射荧光和共聚焦技术之前，几乎不需要在物镜和目镜之间插入较厚的光学组件-透镜间空间。标准的160mm或170mm镜筒长度，物镜安装法兰与目镜座之间的距离非常适用。这些仪器在中间透镜空间会聚了光线。冶金学家和地质学家需要偏振光，在发明薄晶圆偏振器之前，这需要在该空间中插入大型棱镜和其他附件。1930年代，一家制造商的标准管空间不足，并且由于棱镜而引起的像差校正问题困扰，他们首先尝试使用无穷大光学器件来解决这些问题。
　　术语“无限远”是指将物镜设计为将其图像投影到无限远而不是有限的距离。无限光学系统在物镜和目镜之间提供了平行光区域。使用这些系统，可以在不引入光学像差或减小物镜的自由工作距离的情况下，将复杂的光学组件插入该平行光空间。该系统还保留了物镜集的共聚焦性（图2）。呈现在图2中图为CFI60光路的概念图。Infinity光学系统由一个物镜，一个会聚光束的套筒透镜和一个目镜组成。可以将模块和组件放置在物镜和套管透镜之间的平行光路中，以创建一个灵活的系统，而无需额外的中继光学器件。像点的位置在轴向和横向都保持恒定，在物镜和套筒透镜之间的对准也是如此。
　　当然，为了形成我们可以看到或记录的图像，来自无限远型物镜的光必须通过管状透镜或第二物镜再次在平行光空间和目镜之间会聚。通常，可以在不降低性能的情况下将两个主要光学组件放置在该空间中，一种情况下最多三个。
　　现在可以设计附件和插入的组件，以实现正好1倍的放大倍率，这在将几种光学技术与同一样品进行比较时非常有价值。例如，当安装了落射荧光和微分干涉对比（DIC）光学器件时，仍然有空间容纳第三个设备-放大倍率器，示教头，用于两个摄像机的多端口组件或用于与数字化板以跟踪神经元。
　　在数年前的经典显微镜中，物镜设计者可以在校正像差，球面和色差（轴向和横向）像差，彗形像差，像散和像场弯曲时共同考虑物镜和目镜。横向色差（LCA）也称为倍率色差-在同一焦平面上形成红色，绿色和蓝色图像，但每种颜色形成不同尺寸的图像。
　　传统上，LCA很难校正，通常在物镜中未经校正，无法在目镜中进行补偿。几年前可用的光学眼镜种类和计算技术不足以在物镜范围内校正LCA。在未校正的中间透镜光束中插入较厚的分量会进一步扰乱光学校正。
　　即使在今天，并非所有制造商都已在物镜范围内实现了LCA的校正。尼康公司（纽约州梅尔维尔）开发的新型玻璃配方的色散极低。因此，所有像差都会在物镜本身内得到校正。该公司于1976年推出了经过校正的CF（无色差）物镜，这项新技术在CFI60（无铬无限远，60mm共焦肩高），物镜和目镜（尼康）中不断发展。在设计具有无限长管长度的各种显微镜系统中，只有这种显微镜系统结合了其他设计变更，才能充分利用这一概念。
　　无限远显微镜系统理想物镜的设计比通常的透镜元件要多，因为出射光束必须聚焦在无限远处。此外，对荧光技术的需求，例如M-FISH（多色荧光原位杂交）（图3），其基于收集尽可能多的光子，并且需要更高数值孔径（NA）的透镜。除此之外，共焦技术对于高NA，长工作距离物镜的要求也很深，可以穿透到厚组织中。为了满足这些需求，当今的物镜必须具有更大物理直径的玻璃元件。综上所述，这些要求使旧的物镜尺寸标准过时了。图3所示的示例是成纤维细胞的多色荧光图像，使用CFI60 60X，NA 1.4油浸物镜用Eclipse E800显微镜在胶片上捕获。

　　英格兰显微学会在1800年代中期制定的标准设定了物镜安装螺纹的直径。这个尺寸虽然很宽敞，并且适合于旧的黄铜显微镜，但却成为光学设计的严格限制。此外，以前的共焦肩高工业标准（从样品到物镜安装法兰的距离）不足以解决当前设计的复杂性。这些尺寸的新标准（25mm螺纹直径和60mm齐焦肩高，尼康）使创新的新型物镜成为可能，并确保有足够的改进空间。套筒透镜的焦距为200mm，可以实现很长的工作距离和较高的NA。
　　所述CFI60透镜具有更高的NA比通常可用于标准放大倍率，提供增加的细节的分辨率，更高的聚光倍率，并在共聚焦应用的高性能。Eclipse仪器的许多物镜共有的特性是比正常工作距离长。这样就可以将厚的样品从上到下聚焦，而不必担心破坏盖玻片或损坏物镜本身。浸入油和更换样品一样容易。可以使用厚底的腔室，使用更高放大倍率的物镜可以进行显微操作。
　　在现在揭示细胞内部机制和动态活性的研究中，荧光发射的每个光子都是宝贵的。以的效率收集这些参数需要具有尽可能高的数值孔径的物镜。Plan Fluor 40X NA 1.30油浸透镜结合了放大倍率，高NA，视野平坦度，长工作距离和高紫外线透射率，为荧光研究的高效工作进行了优化。对于同等放大率的物镜，落射照明系统中的图像亮度与数值孔径的四次方成正比。计算表明，将0.65 NA的普通高干物镜与1.30 NA的40X浸入式物镜进行比较，可获得16倍的亮度增加。
　　对于普通的非浸入式40X物镜，即所谓的高干物镜，有很多观察结果。在此放大倍率下，物镜需要较高的NA才能提供40X放大倍率应显示的细节丰富度。通常为40倍物镜提供的NA为0.65。即使在此数值孔径下，显微镜的光学性能也取决于透镜设计者和制造商无法控制的光学组件-样品顶部的盖玻片。显微镜制造商建议盖玻片的厚度为0.17 mm，然后将其刻在物镜的主体上（按照实验室供应商的要求，相当于＃1 1/2盖玻片）。
　　许多标本都准备有其他厚度的盖玻片。这对于低倍率观测几乎没有影响，但在40倍及更高倍数时具有很强的影响力。用物镜设计师的话来说，非标准的盖玻片会破坏物镜的球差。用用户的眼光看，图像失去对比度，显得模糊。
　　0.65是普通40X物镜的NA，更高性能的干物镜可以高达0.95。这些受到盖玻片厚度的不利影响，因此必须在物镜上安装校正环。在观察图像外观的同时可以通过旋转图像来优化图像质量。旋转项圈会改变物镜某些组件的内部间距，不幸的是，这也会改变物镜的有效焦点。实际上，在寻找最清晰图像的同时，必须一只手同时转动衣领，另一只手同时转动精细聚焦旋钮。许多用户从未掌握过该技术。高NA，高干物镜（Nikon）的设计极大地减少了焦点偏移，从而使图像质量的优化更加容易。对于大于0.95的NA，则提供浸没式透镜。
　　除了普通的明场以外，每个制造商都为观察技术列出了不同的特殊物镜，例如相衬，DIC和荧光技术。使用多种技术的研究人员曾经需要为任何给定的放大倍数购买其中一些物镜。到现在为止，要在不显着降低性能的情况下为这四个目的设计一个物镜是不可能的。Plan Fluor DLL物镜（Nikon）在所有这四种模式下均能工作，而不会牺牲图像质量。它们节省了金钱，便利性和物镜转盘上的空间
　　在生活中，我们通常会首先概览整个场景，然后放大引人注目的细节。在显微镜下，我们首先从低倍率开始，然后再转向高倍率。病理学家，学家和植物学家是众多生命科学专业人士中的一员，他们经常依靠低倍率进行定向并从字面上“了解全局”。但是，在许多显微镜上，使用10倍物镜和10倍目镜的倍率为100倍，与自然尺寸相比有了很大的飞跃。由于显微镜师通常不愿更换低倍率目镜，因此低倍率物镜是较低放大倍率的。
　　借助CFI60 0.5X物镜，用户可以在广阔的视野中进行观察和拍照。在50 mm的实际视场中，该物镜可用于大型标本的宏观观察，例如图4所示的ilia茎薄部分。与传统的无限远光学系统相比，物镜提供的图像区域的尺寸大五倍以上。可以在35mm胶片上进行实际尺寸的摄影。
　　主要制造商提供的物镜约为。4倍，2倍甚至1倍倍率。CFI Macroplan 0.5X物镜及其特殊配件在目镜上呈现5X图像，并将在35mm胶片上拍摄自然尺寸的1X图像（参见图4）。物镜提供了的细节和色度校正，使显微镜可以提供的放大倍率。
　　显微镜不仅仅是光学。它是科学家与人体接触最多的实验室仪器。在购买一次可能要坐几个小时的乐器时，考虑身体舒适性至关重要。这在规格表中不容易表达。必须亲身经历。
　　在许多较旧的显微镜（甚至是一些较新的显微镜）中，各种控件都放置在对制造商的位置。这有时会导致尴尬或不便。
　　所有主要制造商都已将人机工程学考虑因素纳入他们的展位设计中，但是Eclipse仪器将人机工程学因素纳入了更高的层次。设计中考虑了有关用户如何坐在其仪器上的广泛研究，对方便到达距离的测量以及对手臂和头部舒适位置的确定。图5（a）中将E800显微镜上的载物台手柄和聚焦控制旋钮的位置与传统显微镜进行了比较。通过保持自然姿势并使双手与身体等距，可以减轻压力。此外，载物台手柄和精细聚焦旋钮的位置也可以用一只手进行操纵，从而提高了观察的舒适度。在尼康的许多显微镜上都可以使用直立和倾斜的目镜镜筒（图5（b）），以确保通过使用自然位置的系统提高检查效率并提高操作员的舒适度。
　　此外，向中间透镜空间添加组件并非总是舒适地完成的。如果像大多数制造商那样仅将组件堆叠在一起，并且将双目观察头和目镜放在它们的顶部，则结果通常是令人不舒服的高视线布置，用户会张开脖子以窥视目镜。在Eclipse中，最多三个组件插入到中间透镜空间中，而无需更改仪器的恒定，方便的眼睛位置。
　　在新的展台中，无论制造的难易程度如何，的控件都放在显微镜专家的位置。彼此结合使用的控件（例如载物台移动和精细对焦）已放置在可以用同一只手的手指进行调节的位置。前臂舒适地放在桌面上，的控件自然落在指尖下。平台的位置低得多，方便了幻灯片更换。载物台控制器可以安装在左侧或右侧进行操作。
　　展台上新设计的其他特性包括大大增强的时间和热稳定性，这对于随时间推移进行的研究（例如有丝分裂研究和胚胎学）非常重要。振动阻尼也增加了，以提高捕获图像的分辨率。
　　是否创建了光学显微镜？尽管市场上的新仪器已将显微镜带入了一个高水平的发展阶段，但只要科学研究继续下去，我们可能永远都无法实现这一物镜。未来的需求将需要我们甚至无法预见的创新。但是，与几年前相比，当今仪器为用户提供了更多的性能和多功能性。

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