微流控PCR, QPCR, RT-PCR & QRT-PCR
1.微流控PCR, QPCR, RT-PCR & QRT-PCR简介见的DNA分析是聚合酶链式反应（或PCR）和定量聚合酶链式反应（qPCR）。两种方法都包含在DNA序列的特定指数扩增中。
PCR和qPCR具有众多应用，例如DNA测序。直接PCR应用之一显然是克隆DNA序列（例如基因）。
它还可以帮助检测到低量的DNA（例如，用于病原体检测，如细菌或病毒）。
就一般生物分析而言，微流控为PCR分析提供了许多优点：
①整个生物过程整合并因此被最终用户简化；
②高通量，多重和高度平行的分析；
③由于反应时间较短和/或分离时间较短，分析速度更快；
④用于即时护理应用的便携式设备；
⑤低试剂消耗量；
⑥每次分析的成本降低。
2.PCR及其在微流体装置中的应用
2.1 PCR需要几种常见混合物的试剂：
①DNA样本：将从中扩增特定序列的原始DNA
②引物：对应于特定扩增DNA序列两端部分序列的一对短核苷酸序列（10-20个碱基对）。他们将因此确定具体的扩增序列。
③核苷酸或更精确的脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）：基本上，将用于合成新的DNA扩增子（即由PCR过程产生的新DNA样品）的4种类型的DNA碱基（A，T，C，G）。
④DNA聚合酶：一种能够通过特异性组装核酸从单链DNA中作为模板创建新DNA链的酶。
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一旦混合物准备好，PCR基本上包含在每个PCR阶段的2或3个不同温度之间的温度循环中：
改性：该步骤在94-98℃下进行并导致DNA熔解，即分离DNA链产生两个单独的单链DNA。
退火：该步骤在50-65℃下进行以允许引物退火至与特定扩增的DNA序列的两个末端对应的特定位置处的单链DNA模板。退火阶段可以在与扩展阶段相同的温度下进行，以仅使用2个不同的温度进行PCR。
延伸：此步骤通常在70°C左右进行。温度主要取决于所使用的DNA聚合酶，因为它对应于DNA聚合酶与引物/单链DNA复合物结合以通过掺入周围核苷酸合成新的互补DNA链的阶段。
2.2 PCR微流体装置和应用
PCR主要依赖于温度循环。因此集成设备的关键技术就是它们的加热方法。
在DNA扩增方法中，PCR是首先在微流控芯片上开发的，因为它是见和简单的核酸扩增方法。实际上，当芯片上进行PCR以利用微流体优势（速度（3,4），并行化（4）和灵敏度（5））时，其结果分析可以容易地在芯片外执行。
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来自Gong等烦人多重集成PCR原型
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来自Pal等具有集成电泳分析的微流控PCR芯片，
从PCR过程可以看出，温度循环和热化系统是PCR装置的关键技术部分。此外，即使温度只能在实验前校准，在PCR过程中监测和控制温度，以获得精确和稳定的样品热量。
为了进一步使PCR微流体装置小型化并加速热处理，可以在其制造期间将金属（大多数为铂）或多晶硅的薄膜直接集成到微流体装置中。
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PCR芯片中的薄膜加热器
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激光加热PCR液滴膜
定量PCR（qPCR）也称为实时PCR，但很容易与反转录PCR（RT-PCR，用于RNA分析）混淆。
qPCR依赖于与PCR相同的原理，取而代之的是PCR产物在扩增过程中实时检测，这归功于与适应性光学激发和检测器相关的萤光受体。
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嵌入剂qPCR的解析曲线分析
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荧光探针机制
与PCR相比，qPCR具有更快的优势（PCR过程中的自动检测），更灵敏，动态范围更广，重复性更好。
与PCR一样，微流体装置能够加速热化过程以实现快速qPCR过程（20分钟内40个qPCR循环，商业标准系统约1小时），有助于缩小PCR工作体积，同时保持相同的扩增效率和灵敏度（即最小核酸浓度可检测）比常规商业系统。
微流体装置也被开发用于平行病原体检测（水寄生虫）使用毛细管注射和预装引物，大大简化了系统的复杂性和最终用户的任务。
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微流体qPCR装置
PCR可用于DNA检测，但它也可用于通过简单地向PCR过程添加先前步骤来检测RNA。事实上，RNA结构非常接近DNA，但含有核糖而不是脱氧核糖和碱基而不是胸腺嘧啶。而且，在其大部分生物学作用中，RNA是单链分子，比DNA序列短得多。通过RT-PCR进行RNA定量的主要应用是来自信使RNA（mRNA）和病毒检测（许多病毒是RNA病毒）的基因表达分析。
在70年代，发现了逆转录酶，即能够使DNA在RNA中逆转录的酶。因此，通过使用包含逆转录聚合酶和大约50℃的先前热化步骤的PCR生物化学试剂，可以从RNA中获得互补DNA（cDNA），然后可以像常规PCR过程那样扩增cDNA。
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DNA和RNA之间的差异
以与PCR和qPCR相同的方式，可以在qRT-PCR过程的扩增期间实时检测RT-PCR产物。区分RT-PCR和qPCR很重要。RT-PCR以前可用于逆转录聚合酶链式反应和实时聚合酶链式反应。所以使用RT-PCR很容易让人对上述过程感到困惑。所以现在使用定量聚合酶链式反应及其缩写qPCR代替实时聚合酶链式反应。定量逆转录聚合酶链式反应是如此简化的qRT-PCR。
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RT-PCR：不同的RT引物类型
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RT-PCR：一步和两步法
两步qRT-PCR也可用于进行病毒离片RT步骤，然后用微流控芯片进行PCR以加速处理持续时间（15分钟（31）30个循环，17分钟40个循环（ 35）），同时保持商业系统的效率和灵敏度（31）或降低它们（35）。
一步式qRT-PCR也已经用与热和光学系统有关的聚合物微流控芯片制成，但与商业系统相比产生降低的效率（36）。其他集成系统通过将反应时间缩短至35分钟达50个循环（37），在芯片上进行一步式双相样品qRT-PCR（37），将循环阈值与商业系统进行比较，但不考虑效率和灵敏度。
最初，RT-PCR产物也可以通过比色法在微流控芯片内进行检测，使用免疫层析试纸条，如妊娠试验中使用的那些（38）。这种类型的系统大大简化了检测设置，因为它不需要任何光学分析。
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与免疫色谱（或侧向流动）检测相关的微流控RT-PCR测定
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Microfluidic Continuous Flow/Flow-through system for 30 PCR cycles with the different heating zones pointed out
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Microfluidic Oscillating flow PCR chip. The 1st RTV layer correspond to the PDMS Quake valve and the second one to the PDMS microfluidic channels for PCR sample.
随着微流体技术的发展，出现了处理微流体装置内的乳液和液滴的数字微流体。现在，数字PCR（dPCR）已通过多家公司商业化，专门用于超灵敏检测。尽管如此，dPCR需要更长的加热时间以在所有产生的液滴在PCR管中转移后获得均匀的热化。
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初期数字微流体装置
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数字PCR用于罕见突变检测
单细胞PCR / RT-PCR的优势在于可以精确定量和区分每个单细胞的基因表达，即使它们代表了细胞群体中相对非常小的一个群体，而不会在获得的平均基因表达中丢失通过评估细胞类型的所有细胞。因此可以检测到非常罕见的生物事件。
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单细胞RT PCR分析，来自White等，PNAS，2011
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用于单细胞分析的微流体液滴qRT-PCR装置来自Eastburn等，Analytical Chemistry，2013
微流体已广泛用于不同的DNA扩增过程（PCR，qPCR，RT-PCR）。微流体装置能够加速PCR过程，减少试剂消耗，达到高通量分析并将PCR前后分析整合在一起。
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